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Systems Biotechnology of Recombinant Protein Production in Aspergillus niger
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Author:
TU Braunschweig, 11. July 2011
pages: 192
edition: 1 Aufl.
Volume: 58
language: EN
ISBN-10: 3869558083
ISBN-13: 9783869558080
allocated areas:
Biologie | Biochemie
category:
Dissertation
source of supply
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Kurzbeschreibung
Filamentöse Pilze wie Aspergillus niger sind wichtige Zellfabriken in der industriellen Biotechnologie, besonders für die Produktion von hochwertigen Feinchemikalien, Antibiotika, Enzymen und organische Säuren. In submersen Kulturen weisen filamentöse Pilze eine komplexe Morphologie auf und wachsen als Pellets oder feine Myzelien. Obwohl schwer zu kontrollieren, existiert ein enger Zusammenhang zwischen der morphologischen Struktur und wichtigen Produktionseigenschaften.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird ein systembiotechnologischer Ansatz vorgestellt, der auf das maßgeschneiderte Design der Morphologie von A. niger abzielt, um optimale Syntheseeigenschaften einzustellen. In systematischen Untersuchungen wurde dabei zunächst gezeigt, dass sich durch Zugabe von Mikropartikeln aus Talk, Aluminiumoxid oder Titanat in einem neuartigen Verfahren die Morphologie von A. niger gezielt steuern lässt und man Pellets gewünschten Durchmessers bis hin zu Mycelstrukturen reproduzierbar durch Wahl von Partikelmaterial, -größe und -menge einstellen kann. Diese ermöglichen eine signifikant verbesserte Produktion rekombinanter Proteine, wie für verschiedene Stämme gezeigt, der eine durch den Einfluss der Partikel hochproduktive Biomasse zugrunde liegt. Gekoppelt an modellgestützte Medienoptimierung und die Entwicklung effizienter Prozessführungs-strategien konnte durch Einsatz von Talkmikropartikeln die Produktion von ß Fructofuranosidase in einem rekombinanten A. niger optimiert werden. Dabei stellt der erreichte Enzymtiter von (2800 U/mL) eine zehnfache Steigerung gegenüber allen bisher beschriebenen Verfahren dar. Das auf diese Weise hergestellte, in den Überstand sekretierte Enzym kann effizient für die Synthese von hochwertigen präbiotischen Oligosacchariden mit Anwendungen in der Lebensmittel- oder Pharmaindustrie eingesetzt werden. Bei minimaler Behandlung lassen sich aus Saccharose innerhalb von 10 min etwa 450 g/L an Oligozucker wie Nystose oder Kestose synthetisieren. Die Möglichkeit der maßgeschneiderten Einstellung von Morphologie erlaubt nun auch erstmals deren gezielte Untersuchung.
Ergänzend wurde A. niger auf der Ebene des metabolischen Netzwerks, 13C Fluxomics analysen und in silico Pathway-Analysen charakterisiert. Dies ergab faszinierende Einblicke in den zugrunde liegenden Metabolismus und neue Ansatzpunkte für die weitere Entwicklung filamentöser Mikroorganismen als Zellfabrik für die Produktion rekombinanter Proteine.
Description
The filamentous fungus Aspergillus niger is an important efficient microbial cell factory for industrial production of enzymes as well as organic acids or antibiotics. In submerged cultivation, A. niger exhibits a rather complex morphology which typically has a strong influence on production performance. Although difficult to control so far, the morphological shape is obviously linked to key production characteristics of fungal cell factories.
In this regard, comprehensive approaches, combining systems wide analysis and optimization at the cellular level with process driven engineering of the bioreactor environment, seem most useful in order to achieve superior production processes. This was applied to recombinant proteins production in A. niger. The optimization included the use of talc or alumina micro particles, added to the culture, which allowed to the precise controlling the morphological shape of A. niger and increase enzyme production in different recombinant strains. Additionally, the targeted engineering of the morphology of A. niger into high-producing bio-pellet forms of various sizes by the addition of titanate micro particles was demonstrated. This strategy was combined with model-based medium design and development of efficient fed-batch strategies to optimize the production of the high-value enzyme fructofuranosidase, an important biocatalyst for neo-sugar in food or pharmaceutical industry, in the recombinant strain A. niger SKAn1015. As a result, the achieved enzyme titre could be increased to 2,800 U/mL, more than tenfold as compared to previously described processes. The enzyme, obtained by this micro particle enhanced process, could be applied as biocatalyst with minimal pre-treatment for the biosynthesis of 450 g/L of neo-sugar of the inulin type, such as 1 kestose and 1 nystose, which all display pre-biotics with substantial commercial interest.
These studies were complementary by systems biotechnology analysis of A. niger as it is expected that this may lead to increased understanding of the context of cellular metabolism, regulation and thus further improvement of strains and processes. Fluxome analyses by 13C isotope studies and in silico design are applied to quantify the underlying carbon core metabolism of A. niger under different conditions. This yielding valuable insights towards the tailor made design of A. niger as a cell factory for recombinant protein production.
Stichwörter
Aspergillus niger, Morphologie-Engineering, Submerskultivierung, Mickropartikeln, Biopellet Design, Medium Design, Bioprozessoptimierung, rekombinant Protein Produktion, Fructofuranosidase, Glucoamylase, Green Fluorescent Protein, Fructooligosaccharide, in silico-Design, Metabolische Netzwerkanalyse, Elementarmoden-Analyse, Amplifizierungs Target, Attenuations Target, 13C Metabolische Flussanalyse, Systembiotechnologie, Metabolic Engineering
Keywords
Aspergillus niger, Morphology Engineering, Submerged Cultivation, Microparticles, Biopellet Design, Medium Design, Bioprocess Optimization, Recombinant Protein Production, Fructofuranosidase, Glucoamylase, Green Fluorescent Protein, neo-sugars, In silico Design, Metabolic network analysis, Elementary flux modes, gene amplification targets, gene attenuation targets, 13C based Metabolic Flux Analysis, Systems Biotechnology, Metabolic Engineering
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